WP1, Fortschritte und Ergebnisse:
Wir haben zwei Arbeiten über QM/MM-Methoden veröffentlicht, die auf die elektronische Struktur und die spektroskopischen Signaturen von Flavinen angewandt wurden. Die erste war eine Arbeit des Berliner Teams. Sie berichtet über eine umfassende Bewertung der verfügbaren Berechnungswerkzeuge für die Untersuchung von Flavinen zur Verfügung stehen, und zeigt die Stärken und Schwächen der einzelnen Methoden auf. Dies war ein Weg, um uns mit all unseren Optionen vertraut zu machen, um die beste Wahl zu treffen, um bei den spezifischen Fragen unserer Forschung voranzukommen. Im zweiten Teil wurden die Variationen beschrieben, die sich ergeben, wenn kovalenten Substitutionen an der Position 8 des Flavinrings ergeben. Beide sind unten aufgeführt.
Im Sommer 2022 reichte die Masterstudentin ihre Dissertation über die Berechnung der Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen in den beiden Flavinstellen des ETF von A. fermentans ein und verteidigte sie. Obwohl sie im Herbst 2022 formell in Doktorandenkursen eingeschrieben war, arbeitete die Studentin mit dem Stipendiaten und Prof. Mroginski zusammen, um die Arbeit für die Veröffentlichung vorzubereiten. Neben der Dokumentation der Redox-gekoppelten Reorganisation des H-Bindungsnetzwerks, das das ET-Flavin unterstützt, identifizierte diese Arbeit eine besondere H-Bindung mit dem ungewöhnlich stabilen ASQ-Zustand dieser Stelle und stellte fest, dass diese spezifisch für das NHδ-Tautomer des konservierten His ist, das identifiziert wurde. Im Frühjahr 2023 reichten wir diese Arbeit zur Veröffentlichung ein (Abbildung 1). Sie wurde im April überarbeitet und erschien im Juni online (außerhalb des aktuellen Berichtszeitraums).
In der Zwischenzeit erwarb der zweite Postdoc Kompetenz mit unserem System und arbeitete im Sommer 2022 aktiv mit einem KY-Studenten zusammen, um Molekulardynamikberechnungen, die an der TU-Berlin durchgeführt wurden, zur Interpretation der Ergebnisse der Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) zu nutzen, die in den USA am Oak Ridge National Lab durchgeführt wurden.
Herausforderungen:
Die größte Herausforderung bei diesem Projekt war unsere Schwierigkeit, Postdoktoranden für diese Position zu gewinnen. Dies hat uns viel Zeit gekostet, die wir produktiver hätten nutzen können.
Im Zuge der Ausarbeitung des Manuskripts des Masterstudenten unternahm der Student Energieminimierungen alternativer Konformationen der Bfflavin-Stelle, bei denen die Aminosäure-Seitenkette, die eine verdächtige H-Bindung bildet, neu ausgerichtet wurde, um plausiblere Wechselwirkungen zu bilden. Während die ursprüngliche Reihe von Energieminimierungen alle mit der kristallographischen Konformation der bifurkierenden Stelle begonnen hatte und dort mit nur winzigen Änderungen fixiert blieb, ergaben die neuen Optimierungen eine neue Konformation mit einer Energie von weniger als 1 Cal/mol der ursprünglichen Konformation für den vollständig reduzierten Zustand dieser Stelle.
Die anderen Oxidationszustände dieser Stelle behielten die energetische Präferenz für die aus der Kristallstruktur abgeleitete Konformation bei, so dass die neu entdeckte Alternative spezifisch für den Flavin-HQ-Zustand ist und eine mögliche redox-gekoppelte Konformationsänderung darstellt.
Dieses Ergebnis ergab sich im Rahmen von QM/MM-Rechnungen, die sich auf die unmittelbare Umgebung des Flavins konzentrierten. Wir bemühen uns jedoch nun um eine unabhängige Bewertung der möglichen Bedeutung der neuen Konformation. Es ist zu erwarten, dass umfangreiche Molekulardynamikberechnungen, die derzeit durchgeführt werden, zumindest gelegentlich die gleiche Konformation entdecken, wenn es sich um einen wahrscheinlichen Zustand des Proteins handelt. Wir verfolgen die Abstände, die diese Konformation von der kristallographischen Konformation unterscheiden, in unseren MD-Trajektorien.
Beziehung zu den ursprünglichen Plänen:
Wir hatten vorgeschlagen, elektronische Strukturen für die Flavine an optimierten Stellen von A. fermentans ETF zu berechnen. Leider ist der damit beauftragte Postdoc ohne Kündigung gegangen. Wir konzentrieren uns nun auf die Einreichung von Veröffentlichungen zu erfolgreich abgeschlossenen Arbeiten.
WP2, Fortschritte und Ergebnisse:
Dynamische Kernpolarisation (DNP) wurde an einer Probe eingesetzt, die 15N-markiertes Flavin in 14N-Protein gebunden enthält. DNP führt zu einer 22-fachen Verstärkung der Signalamplitude, wenn sich das Protein in einem mikrokristallinen Zustand befindet und mit dem Polarisationsmittel inkubiert wurde. Es wurden zwei Signale in einem Spektralbereich beobachtet, der mit N3 oder N10 kompatibel ist. 57 mg Material wurden in 1,9-mm-Rotoren gesponnen und bei 80 MHz für 15N beobachtet. Es wurden also wichtige methodische Fortschritte erzielt, auch wenn sich das gewünschte Ergebnis als schwer zu erreichen erwies. Das Protein, mit dem wir anfangs arbeiteten, war nicht gut genug für eine umfassende NMR-Untersuchung, so dass der Stipendiat eine umfangreiche Datenbankrecherche durchführte und einige neue Sequenzen identifizierte, die Fusionen der beiden kanonischen ETF-Untereinheiten darstellen. Das klonierte und exprimierte Gen für die monomere ETF aus Sulfolobus acidocaldarius produzierte viel mehr Protein, das sich zudem viel besser verhält als das im ursprünglichen Vorschlag beschriebene Protein. Daher arbeiten wir jetzt mit dem Protein aus S. acidocaldarius. Die von der ETF hergestellten Proben scheinen ein Jahr lang intakt zu bleiben und haben sehr gute 1H15N-Korrelationsspektren ergeben. Diese bilden die Grundlage für eine Arbeit, die jetzt veröffentlicht wird, allerdings außerhalb des in diesem Bericht beschriebenen Zeitraums (Frühjahr 2024).
Die 15N-Signale von 15N-Flavin in 14N-Protein sind schwieriger zu erhalten, als sie sein sollten. Eine Möglichkeit ist, dass die enorme Anisotropie der chemischen Verschiebung der N5- (und N1-) Signale DNP und Kreuzpolarisation (CP) bei den verwendeten hohen Feldern zu ineffizient macht. Wir hatten vor, die Spektrometerbedingungen mit einer kommerziell erhältlichen Modellverbindung wie 15N-Guanin zu optimieren. Allerdings können wir den Doktoranden nicht als Geisel für schwierige Probleme nehmen, so dass diese Idee in andere Hände gelegt werden muss. Um eine Geschichte für seine Dissertation zu vervollständigen, wählte der Doktorand einen pragmatischen Ansatz zur Überwachung von Konformationsänderungen unter Verwendung von 19F-NMR, wie im ursprünglichen Vorschlag vorgeschlagen. Er verfolgt zwei komplementäre Ansätze zur Einbeziehung von 19F-Tyr in die ETF und wird die Veränderungen der chemischen Verschiebung von 19F-NMR als Indikatoren für Konformationsänderungen verwenden. 19F eignet sich aufgrund seiner enormen chemischen Verschiebungsdispersion besonders gut für dieses Problem. Tyr ist an mehreren strategischen Stellen in der ETF vorhanden, und der Student hat eine weitere an einer besonders interessanten Stelle an der Schnittstelle zwischen den Domänen eingeführt. Schließlich hat der Masterstudent in einer neuen Zusammenarbeit mit der Dobbek-Gruppe (Humboldt-Universität) auch Kristallisationen mit dem von dem Doktoranden für WP2 hergestellten Protein gescreent.
Entscheidend ist, dass der Masterstudent über beträchtliche Erfahrung mit der Proteinkristallographie verfügt und die Dobbek-Gruppe Systeme für die anaerobe Manipulation und Charakterisierung von Proteinen eingerichtet hat. Bezug zu den ursprünglichen Plänen: Obwohl die Verwendung von 19F-NMR vorgeschlagen wurde, hat sich die Art und Weise, wie wir sie einsetzen wollen, weiterentwickelt, da wir die Herausforderungen und Möglichkeiten von ETFs besser einschätzen können. Die Gewinnung von NMR-Signaturen der Konformationsänderung auf Domänenebene ist jetzt viel dringlicher als zum Zeitpunkt der Einreichung des Vorschlags. Wenn wir nachweisen können, dass sich bestimmte chemische Verschiebungen von Tyr 19F als Reaktion auf Ereignisse ändern, die als Auslöser für eine Konformationsänderung angenommen werden, wird dies die Grundlage für einen Artikel in einer Fachzeitschrift mit hohem Einfluss sein.
Ebenso werden alle Erfolge in der Kristallographie sehr wichtig sein, da dieser neue ETF unseres Wissens nach der erste Monomer ist, bei dem die beiden einzelnen Untereinheiten verschmolzen sind. Daher haben wir dieses Projekt weiterverfolgt, obwohl es in den ursprünglichen Plänen nicht vorgesehen war.
(Übersetzt aus dem englischen Original.)
