Biologische Photorezeptoren nutzen Licht entweder für die Umwandlung von Energie oder als Informationsquelle. Die jeweilige physiologische Funktion wird durch die Lichtabsorption des Protein-gebundenen Chromophors eingeleitet, der isomerisiert und anschließend konformationell relaxiert. Die nachfolgenden Reaktionsschritte umfassen häufig Protonenverschiebungen und in jedem Fall Proteinstrukturänderungen. Die Reaktionsschritte, dere Deails in Art und Sequenz in den verschiedenen Photorezeptoren differieren können, sind schließlich entweder an den Transfer von Ladungen (Energiekonversion) oder die Schaltung zwischen einem inaktiven und aktiven Zustand (Sensorik) gekoppelt.
In diesem Projekt haben wir Vertreter beider Klassen von Photorezeptoren untersucht, wobei wir einen interdisziplinären Ansatz mit Methoden aus Spektroskopie, Molekularbiologie und Theorie verwendet haben. Als sensorischen Photorezeptor haben wir das Cyanobacteriochrom Slr1393 aus Synechocystis sp. PCC6803 gewählt, das einen linearen Tetrapyrrol-Chromophor enthalt. Slr1393 aktiviert bei Photoanregung eine Cyclase. Hier waren wir besonders an der Bedeutung einzelner Aminosäuren, speziell Trp496, für die strukturellen und mechanistischen Eigenschaften des SIr1393 interessiert. Dementsprechend wurde diese Aminosäure durch andere natürliche wie auch, als besondere Herausforderung, nicht-kanonische Aminosäuren ausgetauscht, was die Umprogrammierung des genetischen Codes erforderte. Diese Aminosäuren tragen eine Nitrilgruppe, die als Reporter für die lokalen elektrischen Felder dient und mittels IR Spektroskopie abgefragt werden kann (Schwingungs-Stark-Effekt). Zusätzlich haben wir die UV-vis-Absorptions-, Fluoreszenz- und Resonanz-Raman(RR)-Spektroskopie eingesetzt, um selektiv die Tryptophane und den Chromophor beim Übergang zwischen den stabilen Zuständen Pr und Pg zu untersuchen. Die Ergebnisse bestätigen die kristallographischen Analysen bezüglich der starken Wechselwirkungen zwischen dem Chromophor und Trp496 im Pr und die Trennung beider Einheiten im Pg. Allerdings kann die Verschiebung des Trp496 in die Lösung ausgeschlossen werden. Zusätzlich wurde gefunden, dass Trp496 eine wichtige Rolle für den Reaktionsmechanismus spielt, da jede Substitution dieses Restes die Anreicherung eines Intermediats verhindert, das im Wildtyp relativ stabil ist. Im zweiten Teilprojekt haben wir das Membran-gebundene, Natrium-pumpende bakterielle Rhodopsin KR2 aus Krokinobacter eikastus (KR2) als einen Energie-konvertierenden Photorezeptor studiert. In KR2 ist ein Retinal-Chromophor über eine Schiff'sche Base an das Protein gebunden.
Bei Lichtabsorption durchläuft KR2 einen Photozyklus, der mit dem aktiven Transport von Natriumionen über die Membran verbunden ist. Der Photozyklus endet nach ca. einer Sekunde mit der Wiederherstellung des Ausgangszustandes. Hier haben wir in erster Linie zeitaufgelöste RR Spektroskopie eingesetzt, um die zeitliche Entwicklung der einzelnen Intermediate während des Photozyklus zu verfolgen. Die Untersuchungen zielten nicht nur auf tiefere Einsichten in die Struktur-Dynamik-Beziehungen dieses Photorezeptors, sondern auch auf eine methodische Entwicklung der zeitaufgelösten RR Spektroskopie, um eine Reihe von Defiziten früherer Ansätze zu überwinden. Nach der Optimierung an Hand des KR2, wurde der Aufbau auch für andere Retinalproteine eingesetzt, um die Vielseitigkeit dieser zeitaufgelösten RR Technik bei Photorezeptoren zu dokumentieren.
Insgesamt lieferte dieses Projekt wichtige Ergebnisse für ein besseres Verständnis des Cyanobacteriochroms Slr1393 und des Retinalproteins KR2. Die Befunde sind auch in einem größeren Zusammenhang für die Forschung an Photorezeptoren im Allgemeinen sowie für die Entwicklung von optimierten analytischen Techniken von Bedeutung.